Interacciones NO-O2.

 

La SOD (superóxido dismutasa) y los inhibidores de la NOS (la enzima sintetiza óxido nítrico) impiden la mayor parte de daños tisulares y vasculares observados en diferentes modelos de inflamación. Esta observación sugiere que tanto el O2 como el NO son importantes mediadores del daño tisular y de la disfunción orgánica {Granger y Kubes, 1996; Nathan, 1997; Grisham et al., 1998; Hierholzer et al., 1998}.

Sin embargo, ni el O2 ni el NO son citotoxinas ni oxidantes potentes, por lo que se ha sugerido que deben reaccionar rápidamente entre ellos para producir otros agentes oxidantes o citotóxicos más potentes, el principal candidato de los cuales es el peroxinitrito (ONOO), y su ácido conjugado (ONOOH) {Beckman y Koppenol, 1996}, que se genera según la siguiente reacción:

 

O2 + NO ® ONOO

 

Esta hipótesis ha generado un enorme interés porque proporciona una explicación bioquímica para los importantes, aunque controvertidos, efectos protectores de la administración intravenosa de análogos de la l-arginina (inhibidores de la NO sintasa) o de SOD en modelos de daño tisular inflamatorio.

Además, existen numerosos estudios que describen las propiedades fisicoquímicas y citotóxicas del ONOO preformado mediante síntesis química {Pryor y Squadrito, 1995; Beckman y Koppenol, 1996}.

El peroxinitrito en solución neutra es un potente agente capaz de alterar la estructura de distintas moléculas mediante distintas reacciones, entre las que se incluyen la oxidación de tioles y tioésteres, la nitración de residuos de tirosina, la nitración y oxidación de guanosina. Por otro lado, y desde un punto de vista más genérico, puede ser responsable de la degradación de carbohidratos, de iniciar la peroxidación lipídica y de romper la cadena de ADN.

Del grupo de agentes relacionados con estas actividades del peroxinitrito, se considera que el principal responsable de estas reacciones oxidativas es un isómero excitado electrónicamente del ONOOH que presenta las mismas propiedades que OH·- y que NO2 {Pryor y Squadrito, 1995; Beckman y Koppenol, 1996}.

El peroxinitrito existe en equilibrio con el ONOOH y en ausencia de sustrato esta forma protonada se descompone para generar nitrato (NO3) mediante la formación intermediaria del isómero excitado (ONOOH*)

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Sin embargo, aparte de actuar como fuente de oxidantes potencialmente tóxicos, esta misma reacción representa una ruta principal detoxificante y anti-inflamatoria porque puede retirar O2 sin la formación de H2O2 {Granger y Kubes, 1996; Wink y Mitchell, 1998}.

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En otros estudios, se caracterizó cuantitativamente la interacción entre O2 y NO en condiciones fisiológicas {Rubbo et al., 1994; Miles et al., 1996} y se demostró que la generación simultánea de cantidades equivalentes de O2 y NO hace que estos reaccionen para generar un potente oxidante (presumiblemente ONOO). Y se observó que cuando el flujo de uno de los radicales excede al otro, la producción oxidante se reduce significativamente {Miles et al., 1996}.

Se ha propuesto que esta producción menor de ONOO/ONOOH en presencia de un exceso de cualquiera de los dos radicales puede deberse a interacciones químicas secundarias que tengan lugar entre NO o O2 y ONOO/ONOOH.

Y aunque la interacción entre NO o O2 y el peroxinitrito es termodinámicamente posible, el grupo de Pfeiffer sugirió en 1997 que la constante de velocidad de la interacción entre NO y ONOO debe ser demasiado lenta para competir con la descomposición espontánea del ONOO {Pfeiffer et al., 1997}. Por lo que parece mas probable que el NO reaccione y descomponga un isómero específico del HOONO, lo que reduciría de forma significativa la concentración de este potente oxidante {Wink y Mitchell, 1998; Grisham et al., 1999}.

Para precisar las condiciones de la reacción de formación de peroxinitrito, se recurrió a la constante de la velocidad de reacción in vitro para la interacción entre O2 y NO (6 x 109 M-1·s-1). Pero para determinar si el ONOO/ONOOH se forma efectivamente in vivo, debemos tener en cuenta otras consideraciones más importantes por las que tiene lugar una reacción química en un organismo, tales como la constante de velocidad de pseudo-primer orden relativa y no precisamente la constante de velocidad por sí sola. De hecho, la extensión de participación de una reacción concreta está determinada tanto por las concentraciones de los reactantes como por la constante de velocidad {Wink y Mitchell, 1998}.

En relación a esto último, las concentraciones celulares de O2 y NO en condiciones normales son aproximadamente 0.1-1 nM y 0.1-1 mM, respectivamente {Wink y Mitchell, 1998}. Lo que sugiere que la producción de O2 es la que determina la localización de la reacción entre estos radicales y, por tanto, la cantidad de ONOO formada. De forma adicional, la concentración y el coeficiente de difusión del NO determinan si la reacción tiene lugar en alguna localización específica.

Para ilustrar este último concepto, es útil considerar un modelo con dos puntos fuente de NO y de O2 (Figura siguiente). La producción simultánea de O2 y NO por estos puntos fuente produciría un estrés nitrosativo máximo (interacciones NO-O2) cerca de la fuente de NO. Y conforme el NO difunde lejos de su punto de formación, se diluye su concentración de forma proporcional a la distancia difundida. Esto hace que los efectos directos (mayoritariamente protectores) del NO aumentan conforme el radical se aleja de su punto de formación.

Al contrario, cuando el NO se aproxima a la fuente de O2, reacciona con este último y se forma peroxinitrito (ONOO). Sin embargo, cuando el ONOO difunde hacia áreas con exceso de O2 o de NO, se descompone.

Todo esto limita la producción de peroxinitrito (y su estrés oxidativo) a las proximidades de la fuente de O2 (Figura siguiente).

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Difusión e interacción del NO con el superóxido (O2) para formar peroxinitrito (ONOO). El NO diluye su concentración de forma proporcional a la distancia difundida. Por otro lado, al acercarse a la fuente de O2, reaccionan y se forma ONOO. El hecho de que este último se descomponga cuando hay exceso de O2 o de NO limita el estrés oxidativo por ONOO a las proximidades de la fuente de O2.

Estos estudios tienen implicaciones fisiológicas muy importantes, ya que los flujos relativos de O2 y NO parecen controlar la concentración “estándar” de ONOO in vivo. Las situaciones y tipos celulares que podrían producir las cantidades óptimas de O2 y NO para generar ONOO son los macrófagos/microglía y, posiblemente, las células endoteliales/astrocitos reactivos.

Cabe destacar que la producción de radicales libres de oxígeno (ROS) mitocondrial no resulta tan decisiva en el estrés nitrosativo puesto que debe haber un equilibrio entre la producción de uno y otro tipo de radicales libres. De hecho, los neutrófilos cuando son fuertemente activados pueden llegar a producir hasta mil veces más O2 que NO, por lo que generarían muy poco ONOO/ONOOH, tal como se observa experimentalmente {Grisham et al., 1999}.

Esta reacción también depende de la competencia por el O2 del NO con la SOD (superóxido dismutasa). Por ejemplo, la SOD reacciona con el O2 a una constante de velocidad similar a la de la reacción del O2 con el NO, lo que hace que represente la reacción competitiva más importante.

Tal es así que la célula presenta mayor concentración de SOD en el orgánulo en el que se produce la inmensa mayoría de O2 (entre 4 y 10 mM en el citoplasma y hasta 20 mM en la mitocondria). No debemos olvidar que para que el 10% del O2 formado sea convertido en ONOO, la concentración del NO tendría que ser 0.4-5 mM.

Por lo tanto, la reacción del O2 con el NO, a pesar del alta constante de velocidad, está probablemente confinada a lugares específicos, por ejemplo, la generación específica, en gran parte la misma ruta que la del OH.

Pero, aparte de las reacciones de oxidación, el ONOO es capaz de nitrar in vitro ciertos compuestos fenólicos como la tirosina y generar, en primer lugar, 3-nitrotirosina (3-NT).

 

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Productos derivados de la interacción de radicales libres con la tirosina. La importancia de la generación de estos compuestos radica en que pueden ejercer efectos deletéreos sobre las células, tales como la alteración de la síntesis proteica o de la señalización celular. Abreviaturas: m-, meta-; o-, orto-. Adaptado de mi tesis doctoral {Lorenzo-Villegas, 2009}.

La nitración de ciertos residuos de tirosina puede ejercer efectos fisiológicos dramáticos ya que puede alterar las reacciones de las quinasas y las subsecuentes rutas de señalización, rutas para las que la tirosina juega un papel esencial.

En lo que respecta a la relación entre nitrotirosinas y estrés nitrosativo. Algunos investigadores han sugerido que la presencia de 3-NT en las muestras obtenidas de tejidos inflamados es una evidencia de la formación de ONOO in vivo. No obstante, otros estudios sugieren que este no debe ser necesariamente el caso, ya que se ha descrito que la 3-NT puede formarse por acción de los PMNs humanos activados a través de la oxidación de NO2 y tirosina-dependientes de H2O2 catalizada por la mieloperoxidasa, sin la formación intermediaria de ONOO.

Estos datos sugieren que la 3-NT no refleja necesariamente la formación de ONOO pero debe indicar más claramente la producción de NO2 derivado del NO.

En otro estudio, Pfeiffer y Mayer demostraron que, cuando se produce NO y O2 a igual velocidad, no tiene lugar la nitrosación de las tirosinas o lo hace de forma muy poco significativa, que la nitración es más eficiente cuando hay un solo donador de NO y que cuando la producción de O2 excede a la de NO, la formación de 3-NT es indetectable. Dados estos resultados, los investigadores concluyeron que la formación de 3-NT no procede necesariamente de la formación de ONOO in vivo {Pfeiffer y Mayer, 1998}.

Pero el NO puede llevar a cabo numerosas reacciones potenciales que deben influenciar de forma importante una gran variedad de procesos fisiológicos y fisiopatológicos. La determinación del tiempo, la localización, y los ritmos de producción del NO y las especies reactivas de óxido de nitrógeno ayuda a identificar cuales de estas muchas reacciones dependientes del NO son importantes para la modulación de la respuesta inflamatoria.

Por todo esto y dada la complejidad de las reacciones entre radicales libres de oxígeno y de nitrógeno, en cada situación concreta es necesaria una comprensión básica de la química fisiológica del NO para diseñar las estrategias terapéuticas adecuadas al daño tisular inflamatorio. Sin embargo, se pueden seguir unas pautas generales que disminuyan, sino la producción de los distintos radicales responsables de estrés oxidativo, sí los efectos nocivos que estos pueden tener sobre las estructuras celulares. Efectos que repercuten, como vimos anteriormente, en la eficiencia de los procesos celulares básicos y, en última instancia, en la aceleración del proceso de envejecimiento celular. Una de las pautas más eficaces y fáciles de seguir es el consumo de antioxidantes en la dieta.

 

BIBLIOGRAFÍA

 

Beckman, J. S. & Koppenol, W. H. (1996). Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite: the good, the bad, and ugly. Am J Physiol 271: C1424-37.

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Grisham, M. B.; Granger, D. N. & Lefer, D. J. (1998). Modulation of leukocyte-endothelial interactions by reactive metabolites of oxygen and nitrogen: relevance to ischemic heart disease. Free Radic Biol Med 25: 404-33.

Grisham, M. B.; Jourd’Heuil, D. & Wink, D. A. (1999). Nitric oxide. I. Physiological chemistry of nitric oxide and its metabolites:implications in inflammation. Am J Physiol 276: G315-21.

Hierholzer, C.; Harbrecht, B.; Menezes, J. M.; Kane, J.; MacMicking, J.; Nathan, C. F.; Peitzman, A. B.; Billiar, T. R. & Tweardy, D. J. (1998). Essential role of induced nitric oxide in the initiation of the inflammatory response after hemorrhagic shock. J Exp Med 187: 917-28.

Lorenzo-Villegas, D. L. (2009). Modulación por adenosín-trifosfato y derivados purinérgicos de mecanismos proinflamatorios en el sistema nervioso central: inducción de la enzima óxido nítrico sintasa de tipo 2. Tesis Doctoral (ULPGC).

Miles, A. M.; Bohle, D. S.; Glassbrenner, P. A.; Hansert, B.; Wink, D. A. & Grisham, M. B. (1996). Modulation of superoxide-dependent oxidation and hydroxylation reactions by nitric oxide. J Biol Chem 271: 40-7.

Nathan, C. (1997). Inducible nitric oxide synthase: what difference does it make? J Clin Invest 100: 2417-23.

Pfeiffer, S.; Gorren, A. C.; Schmidt, K.; Werner, E. R.; Hansert, B.; Bohle, D. S. & Mayer, B. (1997). Metabolic fate of peroxynitrite in aqueous solution. Reaction with nitric oxide and pH-dependent decomposition to nitrite and oxygen in a 2:1 stoichiometry. J Biol Chem 272: 3465-70.

Pfeiffer, S. & Mayer, B. (1998). Lack of tyrosine nitration by peroxynitrite generated at physiological pH. J Biol Chem 273: 27280-5.

Pryor, W. A. & Squadrito, G. L. (1995). The chemistry of peroxynitrite: a product from the reaction of nitric oxide with superoxide. Am J Physiol 268: L699-722.

Rubbo, H.; Radi, R.; Trujillo, M.; Telleri, R.; Kalyanaraman, B.; Barnes, S.; Kirk, M. & Freeman, B. A. (1994). Nitric oxide regulation of superoxide and peroxynitrite-dependent lipid peroxidation. Formation of novel nitrogen-containing oxidized lipid derivatives. J Biol Chem 269: 26066-75.

Wink, D. A. & Mitchell, J. B. (1998). Chemical biology of nitric oxide: Insights into regulatory, cytotoxic, and cytoprotective mechanisms of nitric oxide. Free Radic Biol Med 25: 434-56.

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